вернутся к оглавлению

вернутся
к оглавлению

 

УДК 677.047.254.13

Эффективность электромагнитных воздействий при получении препаратов для биохимической подготовки текстильных материалов

А.Л.Сибирев, К.К.Смирнов, С.А.Кокшаров

Институт химии неводных растворов РАН, г. Иваново
Ивановская государственная медицинская академия

© 1998 Институт химии растворов РАН

Получено 20.11.96 г.



Перспективность развития биохимических технологий облагораживания текстильных материалов определяет актуальность решения вопросов обеспечения предприятий необходимыми биопрепаратами. Применение сухих ферментов сдерживается их высокой стоимостью, ограниченным сроком хранения. Химические методы стабилизации ферментативных продуктов сопряжены с уменьшением их активности. Указанные проблемы разрешимы при использовании свежих растворов ферментов.

Проводимые нами исследования ориентированы на создание средств и методов получения ферментативных фильтратов непосредственно на предприятиях, заинтересованных в их потреблении. Это позволило бы снизить себестоимость продукта за счет исключения стадии лиофильной сушки, оперативно регулировать объемы производства и потребления биопрепаратов в зависимости от рабочей программы предприятий, особенно в современных условиях аритмии их деятельности. В связи с этим актуально привлечение внимания химиков-текстильщиков к основным проблемам биотехнологии получения относительно нового класса ТВВ-ферментов.

Бурное развитие биотехнологий, в основе которых лежит эксплуатация микробиологических систем (штаммов-продуцентов), заставляет более внимательно относиться к фундаментальным биофизическим проблемам культивирования микроорганизмов или биохимическим реакциям ферментов. При культивировании штамма на величину экономического коэффициента (отношение выходной концентрации фермента, например, alpha.gif (865 bytes)-амилазы, на один микроб) влияют внутрипопуляционные межклеточные связи. Если межклеточные каналы связи оптимальны с биофизических позиций, то популяция наращивает выходной продукт с максимальными показателями. Развитие системы во многом зависит от получения энергии для жизнедеятельности клетки микроорганизма не только от биохимических превращений, но также и от подвода энергии извне, например, за счет биорезонансных явлений. Поскольку культивирование микроорганизмов происходит в водной питательной среде, то управление их жизнедеятельностью через изменение состояния растворов является весьма насущной, но слабо решаемой задачей. Вместе с тем в литературе имеется большое количество сведений о существенной восприимчивости биологических объектов к действию слабых магнитных полей [1, 2].

Одна из основных сложностей культивирования микроорганизмов заключается в возможности сбоя продуцентности популяции микроорганизмов в связи с накоплением рефрактильных (покоящихся) клеток и непродуцентных кластеров живых (вегетативных) клеток. Согласно литературным данным и предварительным микробиологическим исследованиям воздействия слабых электрических и магнитных полей позволяют из покоящихся форм (споры, рефрактильные клетки) пополнять кластер живых клеток. При этом родительские особи вновь участвуют в репликации, создавая обновление (аутостабилизацию) генетического фонда популяции и продлевая срок ее эксплуатации

В частности, нами проведена оценка ростовых характеристик штамма Escherichi coli (М17) при обработке питательной среды статическими электрическими и магнитными полями. Выбор такой тест-культуры обусловлен тем, что грамм-отрицательная палочка Е. coli относится к энтеробактериям и обладает высокой приспособляемостью к изменяющимся условиям внешней среды обитания.

Выращивание тест-культуры проводили при t = 37 o С в течение 24 часов на мясо-пептонном агаре с дозированием инокулятивной (посевной) популяции не более 1000 клеток на чашечку Петри. Воздействие электрического поля с параметрами U = 1,2 В, j = (3-6). 10-5 A/см2 осуществляли при помощи стерильных дисковых (S = 1 см2 ) электродов в течение 60 мин после равномерного посева инокулята. Воздействие магнитного поля проводили с помощью постоянного магнита в течение всего времени развития популяции при величине магнитной индукции В = 24. 10-4 Тл. Температуру поддерживали в воздушном термостате с точностью plusmin.gif (855 bytes)0,5 o С. Сравнение контрольных и активированных процессов выполняли по величинам коэффициента выживаемости бактерий (ККОЕ) и относительного его изменения ( cteta.gif (882 bytes)КОЕ) а также относительного изменения числа колониеобразующих клеток вблизи электродов и полюсов delta.gif (873 bytes)NКОЕ i (где i - катод или анод, северный N или южный S полюс):

ККОЕ=( NКОЕ/N).100%       (1)
где N и NКОЕ- соответственно, общее число клеток, рассеянных на площади чашки, и число КОЕ, колониеобразующих клеток (число колоний, подсчитываемых невооруженным глазом.

cteta.gif (882 bytes)КОЕ=[( kave.gif (887 bytes)КОЕ- kave.gif (887 bytes)КОЕ*)/ kave.gif (887 bytes)КОЕ*)].100%       (2)
где kave.gif (887 bytes)КОЕ и kave.gif (887 bytes)КОЕ* - среднестатистические величины коэффицента выживаемости, соответственно после внешнего воздействия и в контрольных опытах.

delta.gif (873 bytes)NКОЕi=[( NКОЕср- NКОЕi)/ NКОЕi)].100%       (3)
где NКОЕср и NКОЕi - соответственно, число колониеобразующих клеток в среднем по всей площади чашки или вблизи электродов и полюсов.

Всего было проведено 80 опытов. Расчетные величины, полученные при достаточной достоверности, сведены в табл. 1. .

Повышение kave.gif (887 bytes)КОЕ обусловлено увеличением вегетативных клеток в общей структуре популяции за счет пробуждения рефрактильной (покоящейся) части клеток. При воздействии электрического поля эффект выше, по сравнению с магнитным. Микроскопические исследования показали, что в первом случае возрастает количество мелких и средних по размерам колоний, а во втором - число средних и больших колоний. Следовательно, электрическое поле в большей мере вызывает пробуждение клеток, т.е. их активацию в латентном периоде, а магнитное поле преимущественно влияет на репродуктивные функции популяции. Четко видна поляризация роста популяции вблизи электродов и полюсов. На фоне общего увеличения числа колоний в анализируемых системах воздействие катодных процессов и N-полюса магнита оказывает более существенный стимулирующий (промотирующий) эффект, менее выраженный у анода или S-полюса магнита.

Таким образом, выявленные эффекты демонстрируют возможность энергетического управления жизнедеятельностью бактериальных популяций при их эксплуатации в биотехнологиях.

Бактериальная популяция неотделима от среды обитания (водных растворов). Как с теоретической, так и с практической точек зрения представляла интерес дифференциация воздействия внешних полей на генотипический (водная среда) и фенотипический (микроорганизм) компоненты системы.

В первой серии экспериментов производили обработку водного физиологического раствора (0,15 М р-р NaCl) с последующим помещением в него инокулята, выдержкой в течение 60 мин и рассеиванием на чашечки Петри. Во второй серии проводили активацию системы с микроорганизмами. Питательной средой является пивное сусло и крахмальный картофельный отвар в стандартном фосфорнокислом солевом буфере (рН = 6,7). Культивирование выполняли в воздушном термостате при t = 37 oС. Всего проведено 125 опытов.

Электрохимическую активацию (ЭХА) осуществляли в мембранном проточном двухэлектродном электролизере. Параметры воздействия: напряжение на ячейке U = 12-100 В; плотность тока  j = 0,3-05 мА/см2; потенциал анода Еar=1,3-1,6 В; катода Еkr== 0,1-0,4 В; скорость прокачки раствора V = 0,1-0,3 л/мин. Воздействие магнитным полем оказывали с помощью тороидальной электромагнитной системы с величиной магнитной индукции В = 115 мТ при динамизации растворов прокачкой по силиконовой трубке со скоростью V = 0,1-0,3 м/мин с числом переполюсовок поля - 24 (МА - магнитная активация). Магнитно-электрическое потенцирование (МЭП) растворов проводили в термостатируемой ячейке с двумя золотыми электродами воздействием переменного векторного магнитного потенциала тороида и динамизации раствора в низкоградиентном переменном электрическом поле. Использованы следующие параметры воздействия: эффективное значение вектора магнитной индукции Вm=(3-6).10-5Тл; эффективное значение магнитного векторного потенциала Аm=(0,2-0,4).10-6Вб/м; амплитудное значение градиента электрического поля Е = 0,33 В/м; частотный диапазон f = 32-4000 Гц. Применяемый набор частот представлял собой линейчатый спектр гармоник, выстроенный относительно основного тона fdelta.gif (873 bytes) = 333,3 Гц, при котором наблюдается максимальная устойчивость динамических состояний водно-электролитных систем [3].

Результаты исследования колониеобразования В. subtilis показывают (см. табл. 2. ), что используемый в работе штамм обладает высокой жизнедеятельностью (обычно среднее значение kave.gif (887 bytes)КОЕ< 60-70 %). В сравнении с тест-культурой, изменения величины cteta.gif (882 bytes)КОЕ значительно ниже, но общие закономерности развития популяций при воздействии внешних полей аналогичны: ЭХА действует на лаг-фазу (фазу пробуждения клеток), а МА - в большей мере на репродуктивные функции.

При этом основной вклад в эффект вносит энергизация водной среды (delta.gif (873 bytes)cteta.gif (882 bytes)КОЕ=70-88%). Следует отметить метод МЭП, для которого характерно максимальное (до 90 %) влияние на прирост колоний через энергизацию водной фазы, несмотря на довольно скромное относительное увеличение биомассы (cteta.gif (882 bytes)КОЕ =6 %). Вместе с тем этот метод обеспечивает существенное повышение активности alpha.gif (865 bytes)-амилазы.

В табл. 3. обобщены результаты анализа кинетики роста биомассы по данным начальной (СNo) и конечной (СN24) концентрации клеток в культуральной жидкости и активности фермента (Аф), определяемой в условных единицах по методике [4].

При анализе динамики роста популяции B. subtilis в контрольном опыте определена продолжительность лаг-фазы 5,5-6 часов; в предлогарифмической фазе скорость нарастания численности клеток составляет dCN /dtau.gif (853 bytes)=0,3.106 мл-1.час-1; максимальное значение в логарифмическом периоде dCN /dtau.gif (853 bytes)=8.106 мл-1.час-1. В фазе преднасыщения, т.е. на выходе в фазу максимальной концентрации биомассы, скорость роста снижается, но ранее достигается максимальное значение активности фермента в культуральном растворе.

После обработки инокулята анолитом наблюдается снижение продолжительности лаг-фазы до 4,5-5 часов и повышение к конечному времени относительной урожайности на 12,7 %. Развитие происходит при увеличении скорости dCN /dtau.gif (853 bytes)=17.106 мл-1.час-1 на 10,8 % возрастает активность фермента. Сильное воздействие на рост биомассы в условиях ее культивирования оказывает катодная обработка питательной среды, относительный delta.gif (873 bytes)CN достигает 28 %, при этом сокращается лаг-фаза до 3 часов и увеличивается скорость роста клеток до dCN /dtau.gif (853 bytes)=43,7.106 мл-1.час-1. Однако при этом активность фермента падает на 15 %. Методы МА и МЭП питательной среды на кинетические параметры и выход биомассы по сравнению с ЭХА влияют незначительно. В зависимости от частотного диапазона МЭП возможно как промотирование (Нч-диапазон), так и ингибирование (Вч-диапазон) указанного процесса (см. табл. 3. ) Вместе с тем налицо резкое (в 7 раз) повышение активности фермента. Такое изменение состояния alpha.gif (865 bytes)-амилазы в культуральной жидкости трудно предсказать a priori. Объяснение этому, по всей вероятности, нужно искать в явлениях биорезонанса [5] и адаптивной диссоциации популяции

Таким образом, управление развитием микробной популяции можно осуществлять генотипически, что реализуемо в реальных процессах продуцирования alpha.gif (865 bytes)-амилазы. Применение метода магнитно-электрического потенцирования питательных растворов может существенно повысить биоэкономичность технологии получения ферментативных фильтратов, применяемых в процессах биохимической подготовки целлюлозных текстильных материалов

 

вернутся к оглавлению

вернутся
к оглавлению